葉綠素的熒光光譜測量

實驗背景：「葉綠素」的光學知識

       葉綠素是植物從光中吸收能量所需的基本色素。它在可(kě)見光譜的藍(lán)色和(hé)紅色部分吸收光較強，在可(kě)見光譜的綠色部分吸收光較弱，這使它在人(rén)的肉眼中成為(wèi)可(kě)識别的綠色。

       葉綠素的檢測可(kě)以追溯到19世紀早期，1817年Joseph Caventou和(hé)Pierre Pelletier将其分離出來(lái)。後來(lái)，利用了立體(tǐ)化學、核磁共振、光學和(hé)質譜等方法檢測了分子的元素組成和(hé)一般結構。

要确定葉綠素濃度，其中一種方法就是測量其熒光發射率。葉綠素在650-800 nm範圍內(nèi)可(kě)以檢測到熒光，再通(tōng)過測量700 nm和(hé)735 nm左右波長的熒光發射峰值，計算(suàn)它們的比值，可(kě)以推導出葉綠素含量的線性關系。

葉綠素的存在是植物呈現綠色的原因，而缺乏葉綠素會(huì)導緻葉子的顔色變成紅色或黃色。基于這一點，我們使熒光發射峰值更高(gāo)，從而得(de)到葉綠素濃度更高(gāo)的綠色一品紅葉。

本實驗将過比較不同顔色一品紅(紅、綠、白)葉片的熒光光譜，測定其葉綠素濃度。

圖1 用于實驗的一品紅植物

溶解在甲醇中的紅色葉片樣本(左)，綠色葉片樣本(中)和(hé)白色葉片樣本(右) 

此外，我們還(hái)将測量一個(gè)白色一品紅片樣本，對比其與紅色和(hé)綠色葉子樣本的葉綠素濃度。測量時(shí)，每一片葉子都被溶解在甲醇中，以便從每個(gè)樣品中分離并提取葉綠素(圖1)。

實驗系統：

本實驗的系統如圖所示(圖2)。光譜儀使用的是AvaSpec-ULS2048CL-EVO，該設備擁有(yǒu)新的光譜學技術。這款光譜儀提供USB3.0通(tōng)信，速度是USB2.0的10倍，使用了CMOS探測器(qì)，AS-7010電(diàn)路闆，這款電(diàn)路闆上(shàng)可(kě)以存儲更多(duō)的光譜，實現更多(duō)功能。此外，這款光譜儀可(kě)以定制(zhì)狹縫尺寸，光栅，光纖入口和(hé)連接器(qì)，以滿足各類應用需求。

圖2：葉綠素測量實驗裝置

其他用于實驗的配件有(yǒu)單色儀, 用于過濾特定波長光源,以确保隻有(yǒu)所需觀察的發射光譜。比色皿支架(CUV-DA)，可(kě)以使樣品暴露在較大(dà)的光量下。一個(gè)比色皿遮罩 (CUV-COVER-DA)，用來(lái)減少(shǎo)環境光的影(yǐng)響。600微米纖芯光纖(FC-UVIR600-1-BX)，用來(lái)連接光譜儀和(hé)比色皿。三個(gè)樣品(紅葉樣品、綠葉樣品和(hé)白葉樣品)都放入比色皿中測量。

實驗方法及數據：

每個(gè)葉片樣本溶解在約30ml的甲醇中，将存有(yǒu)樣本的溶液在120°C的加熱闆上(shàng)加熱1分鍾來(lái)提取葉綠素，再将混合溶液移入比色皿中進行(xíng)分析測量。将單色儀直連到AvaLight-Hal-S-Mini上(shàng)，接着在不同波長之間(jiān)循環測試，直到找到能使樣品達到亮度較大(dà)的波長，此激發波長為(wèi)620 nm處。

數據分析模塊，我們使用了AvaSoft的Sd模式，AvaSoft是我們定制(zhì)的軟件包。Sd模式是測量熒光的常用模式。因為(wèi)Sd模式從每個(gè)波長的原始計數(即範圍模式)中減去暗背景光譜(光譜儀在沒有(yǒu)光源的情況下測量的光譜)。這有(yǒu)助于減少(shǎo)光譜中的噪聲，并更好地隔離發射峰。

調整積分時(shí)間(jiān)可(kě)以增加或減少(shǎo)一次測量的光量，這會(huì)影(yǐng)響結果光譜的整體(tǐ)幅度大(dà)小(xiǎo)。平均次數表明(míng)兩個(gè)值被平均在一起，可(kě)以提供更一緻的光譜結果。實驗時(shí)，我們将積分時(shí)間(jiān)設為(wèi)9秒(miǎo)，平均值設為(wèi)2。此外，我們用試管支架蓋覆蓋了所有(yǒu)樣品，以确保測量的光來(lái)自光源，避免環境光的影(yǐng)響。

實驗結果分析：

圖3：紅色一品紅樣品的熒光光譜

發射峰在673.90 nm和(hé)722.84 nm

圖4：綠色一品紅樣品的熒光光譜

發射峰在687.17 nm和(hé)730.87 nm

圖5：白色一品紅樣品的熒光光譜

發射峰在675.63 nm和(hé)726.28 nm

紅色一品紅葉片樣品的熒光光譜測量到的發射峰在673.90 nm和(hé)722.84 nm(圖3)。這符合與文獻報道(dào)中所描述的的：葉綠素發射峰在650-800 nm之間(jiān)。

綠色一品紅葉片樣品的熒光光譜在687.17 nm和(hé)730.87 nm處顯示更高(gāo)的發射峰(圖4)。與紅色葉片樣品相比，這兩個(gè)峰略高(gāo)，但(dàn)仍與文獻報道(dào)所描述的葉綠素發射峰一緻。

白色一品紅葉片樣品的熒光光譜(圖5)與紅色葉片樣品具有(yǒu)相似的發射峰(675.63 nm和(hé)726.28 nm)，但(dàn)每個(gè)發射峰的強度更大(dà)。

圖6：三種樣品的熒光光譜對比圖

紅色一品紅樣品(紅色線)，綠色一品紅樣品(綠色線)，白色一品紅樣品(藍(lán)色線)

圖6為(wèi)紅色一品紅樣品(紅色線)、綠色一品紅樣品(綠色線)和(hé)白色一品紅樣品(藍(lán)色線)的熒光光譜比較。為(wèi)了直接比較每個(gè)樣品的葉綠素含量，計算(suàn)735 nm和(hé)700nm峰值的比。紅葉樣本，兩個(gè)峰的比值為(wèi)7492.67/26998.33，等于0.278。對于綠葉樣本，比值為(wèi)44973.55/53473.00，即0.841。白葉樣本的比值為(wèi)13650.20/44659.54，即0.306。

綜上(shàng)所述，紅葉和(hé)白葉樣品相比，綠葉樣品中的葉綠素濃度要高(gāo)得(de)多(duō)。此外，紅葉和(hé)白葉樣本的葉綠素濃度相似，盡管白葉樣本比紅葉樣本看起來(lái)更綠。

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